显微镜基础篇丨如何选择合适的物镜

物镜简介

物镜是一种光学元件，可以收集来自被观察物体的光并进行光线聚焦以产生真实图像。它是由单个透镜或镜子组成，也可以是多个光学元件的组合。

显微镜的物镜是靠近样品底部的，它是一款高功率的放大镜，焦距很短，使用时将其靠近要检查的样本，以使来自样本的光聚焦到显微镜镜筒内部的焦点上。

显微镜物镜有两个特征参数：放大倍率和数值孔径（Numerical Aperture，简称NA）。放大倍率通常为2倍至100倍。显微镜镜头的NA值通常在0.10至1.25的范围内，分别对应于约40mm至2mm的焦距。

在显微镜中，作为最靠近样品的光学元件，物镜从标本中收集光，然后将其聚焦以产生在目镜/计算机上看到的图像。我们可以认为物镜是显微镜中最复杂的硬件部分，正是这种复杂性使物镜成为设备最重要的组成部分之一。

物镜的设计和质量差异很大。因此，可以根据以下特征对它们进行大致分类。

物镜分类

1.根据显微成像原理对物镜进行分类：

反射暗场物镜(Reflected dark field objectives)具有特殊的结构，该结构包含一个360度的空心腔，该空心腔是围绕着位于中心的镜头元件。

微分干涉（DIC）物镜-使用无污染的光学元件，并依赖于Nomarski棱镜（或Wollaston棱镜），该棱镜会影响rear focal plane的sheared light beams之间的光程差。

荧光物镜-用石英和特殊玻璃设计，具有从紫外线到红外波段的高透射率。

相差物镜-根据内部相差环的构造和中性密度，这些物镜分为几类，如Dark Low(DL)物镜、Dark Low Low(DLL)物镜、Apodized Dark Low(ADL)物镜、Dark Medium(DM)物镜和Bright Medium(BM)物镜。

2.基于放大倍率的分类：

物镜可以根据其放大倍率分为三大类。其中包括：低倍物镜(2x、4x/5x和10x)，中倍物镜(20x、40x、50x和60x/63x)和高倍物镜(100x)。

除了物镜的放大倍率不同外，物镜使用的介质也不同。例如，对于高倍镜头(60x和100x)，经常使用浸油来获得高分辨力。放大倍率较低的镜头则采用空气作为介质。

3.基于色差校正的分类：

透过透镜的光会产生色差(color aberration)，该色差因波长不同而具有不同的折射率。为了防止这种情况，工程师们开发了以下镜片：

消色差物镜(Achromatic lens)：旨在使两个波长（颜色）光的折射率相同。这种类型的镜头被广泛使用，部分原因是其价格不高。消色差物镜是最简单，最便宜和最常用的物镜。这些物镜旨在校正红色、绿色和蓝色波长中的色差。这种类型的物镜的主要缺点是，它的色差校正能力有限，物镜性能偏低。这些物镜适合于单色相机和低倍物镜的应用。

半复消色差物镜-荧光物镜(Semi-apochromatic lens-fluorite lens)：旨在使三种波长（颜色）的光的折射率相同。这种类型的透镜用于荧光观察，而且可以确保波长约为340nm紫外波段的透射比。

复消色差物镜(Apochromatic lens)：与半复消色差透镜一样，旨在使三种波长（颜色）的光的折射率相同。复消色差物镜则具有更高的精度。对于复消色差物镜，除了有较高的数值孔径和较长的工作距离以外，还可对多个波长进行球差校正。因此复消色差物镜的设计更好，非常适合多光谱的应用。这种类型的镜头具有较大的数值孔径和更好的分辨率，这种高性能意味着价格也更高。

平场物镜（Plan lens），也称为平面物镜、半平场物镜、半平面物镜或微平面物镜，都是用于校正场曲的物镜，在大多数情况下，镜头侧面会标有“PLAN”。场曲是一种像差。当离轴成像无法在平坦的成像平面上集中时，光轴就会出现偏离，进而导致成像变得模糊。下图展示了消色差物镜、半平场物镜和平场物镜依据中心轴径向距离计算得出的视场平坦度。使用消色差物镜校正场曲之下，成像中心具有65%的平面视场。平场物镜能够提供更好的平场校正，使成像具有90%的平面视场。半平场物镜的校正性能介于上述两种物镜之间，能够使成像获得80%的平面视场。

平场校正：消色差物镜65%（左）、半平场物镜80%（中）、平场物镜90%（右）

浸入式物镜(Immersion lens)：通过在物镜和样品之间填充液体来增加数值孔径，以实现高分辨率。分为油浸透镜和水浸透镜，前者在侧面标有“HI”或“OIL”，而后者在侧面标有“W”或“WATER”。

消色差聚光镜：校正色差的聚光镜。消色差非球面聚光镜是可以校正像场弯曲的高级类型。

4.基于光路的分类：

折射物镜是最常用于显微镜中的物镜类别。当光线通过显微镜时，物镜的折射式设计能让光学元件将光线折射或弯曲。每个光学元件的表面都镀有增透膜，其作用是减少背部反射，并改善整体光通量。折射物镜常用于需要极高分辨率的应用中。折射物镜具有多种类型，每种类型都使用不同的光学配置。折射物镜的设计范围可以从配有两个元件的消色差物镜（元件分别为消色差透镜和弯月透镜），到配有十五个元件的平场复消色差物镜。如上文所述，平场复消色差物镜是设计复杂的高端物镜，物镜本身就能够完成色差校正和平场校正。

复消色差物镜（左）与消色差物镜（右）设计

反射物镜是一种具有反射或镜面设计的物镜。尽管反射物镜的大部分校正程度均与折射物镜相同，但在选择物镜时，它常为人们所忽略。反射物镜由第一和第二镜像系统组合而成，其作用为将受观察物体放大成像，然后将该成像反射到目镜中。反射物镜的一个优势是其工作距离长，比起传统的折射物镜，其所采用的镜面能够在紫外区域和红外区域的光谱范围内工作。

剖析反射物镜

主要概念和规格

目前，任何制造商生产的物镜规格都列在物镜外壳上。如果要为预期的实验目的选择正确的物镜，那么了解其各种说明标签的含义很重要。这些说明标签包括：

物镜标准

大部分复式显微镜设计标准均采用德国工业标准（Deutsche Industrie Norm，简称DIN）。DIN标准的显微镜物镜法兰（flange）和目镜法兰之间距离为160mm。除了DIN标准外，同时也有采用日本工业标准（Japanese Industrial Standard，简称JIS）的显微镜。JIS标准的显微镜物镜法兰和目镜法兰之间的距离为170mm。虽然DIN标准和JIS标准的显微镜具有不同的成像距离，但是此距离差异并不会对显微镜的光学性能产生任何影响，并且都能够提供相同高质量的成像。另外，符合这两项标准的显微镜均采用相同的0.7965"x36TPI RMS安装螺纹。

放大倍率

在物镜上，通常由数字和X表示，如100X，10X等。另一方面，在物镜的外周上也会有一个彩色的带，用来指示物镜的放大倍数。例如，物镜下部的黄色带表示它是10倍物镜。

数值孔径（NA）

数值孔径是指焦距和入射光瞳直径的函数。通常将其标记在物镜的放大倍数旁边。较大的数值孔径（大于1）意味着必须使用浸入油，因为不使用浸入油最高的NA只能到达1。要获得较大的角度并提高进入物镜的光线数量（下图方程式），就需要使用油浸物镜（折射率通常为1.5）来改变受观察物体和物镜之间的折射率。数值孔径大的物镜和浸镜油的结合使用提供了一个简单的解决方案，使用户无需花费更多的金钱来选择使用其他物镜。

盖玻片厚度

用数字（例如0.17mm）表示，盖玻片厚度标在物镜上，以说明应使用的盖玻片类型。

当使用显微镜观察带有液体的标本（如细菌、细胞培养物、血液等）时，应将这些组织或切片放在盖玻片上，以免污染受观察物体和显微镜组件。盖玻片又称为显微镜用盖片玻璃，它能够改变光线从物体到物镜的折射。因此，要获得高质量的成像，就必须对物镜进行正确的光学校正。这就是为什么实验人员需要备有一系列厚度的盖玻片，以用于优化物镜。盖玻片厚度通常是标识在无穷符号之后（即表示物镜是有限共轭物镜，或是远场校正物镜），厚度范围介于0（无盖玻片校正）至0.17mm之间。

校正类别

通常在物镜上标明消色差，复消色差，平场和半平场等校正方式。

典型投射性显微镜物镜

视场

视场代表着显微镜系统能够观察到的物体范围。视场的大小是由物镜的放大倍率来决定的。在配有目镜和物镜的显微镜系统中，其物镜的视场是由目镜放大的，从而使用户能够通过目镜观察到物体。然而，在只有电脑显示屏的无目镜的物镜系统中，视场则是传递到相机传感器中。相机传感器是矩形的，所以它能接收到物镜全视场中的矩形成像。相比之下，人眼视网膜则可以看见全视场的整体成像。这就是为什么无目镜的显微镜系统的视场感觉上通常小于目镜显微镜系统的视场。下图俩方程式可用于计算上述系统的视场。

像差校正

显微镜系统性能的高低取决于物镜的质量。在选择合适的物镜类型时，除了放大倍率和设计复杂性之外，了解正确的像差校正也是极为重要的。复消色差物镜非常适合用于白光应用中，而消色差透镜则是单色光应用的最佳选择。然而，这两种物镜都具有一个显著的缺点，那就是当物镜放大倍率提高时，就会出现畸变和场曲问题。

有限共轭

在有限共轭光学设计中，光源（不在无穷远）是集中在一个点上。受观察物体在显微镜中是由物镜放大成像的，然后物镜会将成像反射到目镜或传感器（若使用相机）中。整个显微镜系统透镜之间的距离是根据DIN或JIS标准而定的，所有有限共轭显微镜均采用其中一个标准。有限共轭物镜普遍用于普通显微镜中。此外，有限共轭设计常用于成本和简单设计为主要考量的应用中。

简单的有限共轭显微镜设计

无限共轭（远场校正）

在无限共轭（又称为远场校正）光学设计中，位于无穷远的光源是集中在一个小点上。该小点是物镜中的受观察物体，并且无穷远朝向目镜或相机的传感器。这种设计新颖的显微镜主要是利用物体和目镜之间的额外管透镜来产生成像。虽然此显微镜的结构比有限共轭物镜更为复杂，但是它却允许用户将滤光片、偏振片和分光器等光学组件装入显微镜中。因此，额外的成像分析和外推能够在此设计复杂的显微镜中执行。举例来说，在物镜和管透镜之间添加滤光片能让用户观察到光源的特定波长，或是阻挡会对显微镜设置带来干扰的多余波长。荧光显微镜应用就是采用这种设计类型。无限共轭设计的另一优势是其放大倍率能够随特定应用需求而变化。物镜放大倍率是指管透镜焦距与物镜焦距之间的比率（如下图方程式），管透镜焦距的增长或缩短都会改变物镜的放大倍率。一般管透镜是焦距为200mm的消色差透镜，但是也可以采用其他焦距的透镜，进而帮助定制显微镜系统的总放大倍率。如果所用物镜为无线共轭物镜，物镜主体上会出现无穷远符号。

简单的无限共轭（远场校正）显微镜设计

光学显微应用示例

要了解显微镜组件如何能够与各种光学、成像和光电产品相整合，请考虑使用以下光学显微的应用如荧光显微镜应用。典型的荧光显微镜设置会使用三种滤光片：激发滤光片、发射滤光片和二向色性滤光片。被激发的荧光团是一种荧光染色剂，用于为蛋白、组织和细胞添加荧光标签以供检测或研究。荧光团能够吸收一个波长的光，然后发射（发出荧光）另一波长的光。每个荧光团具有特定的吸收波长或激发波长，而激发滤光片只会透射特定范围的波长。荧光团一旦被激发后，就会发射其他范围的波长。发射滤光片只能用于透射发射波长。二向色性滤光片专为反射发射波长和透射激发波长而设计，其作用为隔开激发通道和发射通道。下图展示了典型的荧光成像设置。

典型荧光显微镜设置

结束语

显微镜和物镜是具有多种用途的复杂光学系统。它们的应用不再仅仅局限于生物应用中（如在生物课上用于观察颊上皮细胞），相反地，用户可以使用这些光学件来观察荧光团中的发射波长、分析加工镜片上的5μm缺陷、监督基片材料脱落的烧蚀过程，以及与各种光学、成像和光电产品搭配使用。在选择物镜时，应将整体显微镜系统性能考虑在内，而并非只考虑到物镜本身的性能。深入了解显微镜各个组成部件的重要性及其规格可帮助实验者选择出最合适的显微镜系统，从而获得最佳结果。

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