照明和显微镜光学系统

光学显微镜的设计必须确保光线有序排列并精确引导通过仪器。样本照明是实现显微镜、关键显微摄影和数字成像中高质量图像的最重要可控变量。在简单的明场显微镜中，亮度不足不是问题，但如果使用对比度增强技术，例如相位对比、微分干涉对比、荧光或偏振对比，则在光束路径中插入额外的光学元件，这些元件会消耗大量可用光流。这种情况会导致观察光很少，因此图像会呈现暗色。经过适当调整后，来自聚光镜的光线将通过投射光锥照亮视场，用成像光填充物镜的后焦平面。聚光镜孔径光阑负责控制照明光锥的角度，从而控制聚光镜的数值孔径。图 1 说明了这一概念，图中显示了一系列聚光器，其光锥（和数值孔径）从左到右逐渐减小。

显微镜中存在固定和可调光阑、棱镜、分束器和滤光片的另一个原因是，每次更换物镜后通常应重置照明。部分原因是，观察标本视野的大小会随着物镜的每次放大而变化。低放大倍数（例如 4 倍）的物镜可提供较大的观察视野（在这种情况下，直径可达 5 毫米，前提是目镜允许观察直径为 20 毫米的中间图像）。如果切换到 40 倍物镜，标本视野的直径将缩小 10 倍（仅为 0.5 毫米）。然后可视区域会缩小 100 倍。第二个原因是数值孔径从 0.12 增加到 0.65，或者以孔径角表示，从 15 度增加到 80 度。图 1 显示了数值孔径对照明光锥大小和形状的影响。

有各种各样的光源可用于照亮显微镜，既可用于常规观察，也可用于定量数字成像。最常见的光源是 30 至 100 瓦的钨卤素灯，因为它成本低且寿命长。这些灯相对较亮，色谱中心为 3200 开尔文（当设置为接近灯的标称电压时），但需要颜色转换滤光片将其色温提高到与日光相当的水平。另一种流行的光源是 75 至 150 瓦的氙弧放电灯，因为它亮度极高且寿命长。氙气灯在可见光谱范围内具有相对均匀的强度输出，色温接近日光。当需要非常高的光强度时，通常使用金属卤化物和汞灯以及激光器。在荧光显微镜中，特别是出于数字成像的目的，过去几十年来一直使用 100 瓦或 200 瓦的汞灯。这些灯正逐渐被更稳定、寿命更长的金属卤化物灯取代，后者在连续区具有更高的强度。发光二极管 (LED) 越来越多地被用作透射光和荧光显微镜照明的光源。

很多年前，人们使用碳弧灯或锆灯泡来实现高水平的照明，但如今这些古老的光源很少见，因为这些灯降低了到达样品的光的质量和均匀性。科勒照明通过产生有组织地穿过样品的平行光束，克服了白炽灯和弧光放电光源遇到的许多限制。科勒策略要求只照亮样品的视野，因为视野外的过多光线包含会降低对比度的散射光。但与此同时，显微镜最关键的方面之一是照明的光锥应始终与物镜的角孔径相匹配，以便有效利用光学器件的整个孔径。这是实现最大分辨率的唯一方法。

图 2 中的剖面图显示了现代显微镜的光学系统和许多其他组件。聚光镜（包含孔径光阑）和通常包含在支架底座中的视场光阑是实现柯勒照明的关键元件。穿过标本的成像光线被显微镜物镜捕获，并被引导到目镜和/或多个相机端口之一。在整个显微镜的光学系统中，照明从光源传播到照亮标本，然后进入目镜或相机附件，通过一系列光阑和透镜引导和聚焦。关闭或打开聚光镜光阑可控制从聚光镜发出并从各个方位到达标本的光线的角度。因为光源本身并没有聚焦在标本的高度，所以标本高度的照明基本上是无颗粒的和延伸的（实际上产生了一个均匀的照明场），并且不会因为聚光镜玻璃表面的灰尘和瑕疵而受到损害。聚光镜孔径光阑的设置，以及物镜的数值孔径，决定了整个显微镜系统的实际数值孔径。照明视场光阑决定了标本的哪一部分和哪大小被照亮。聚光镜的孔径光阑在物镜的光瞳上成像，并调节该光瞳的照明。整个光学系统的设计方式是，光锥的孔径角与孔径光阑一起正确设置。

显微镜中的共轭平面

显微镜包含两组不同的交错光学平面，负责控制照明和成像。这些光学平面统称为共轭平面。第一组平面（称为光瞳平面）控制照明光的光束路径，并在载物台聚光镜孔径光阑的平面、物镜的后焦平面和目镜的视点（也称为拉姆斯登盘）处产生灯丝的聚焦图像。共轭平面处于共同焦点，对于实现正确的柯勒照明至关重要。第二组平面称为成像共轭平面，包括视场光阑、标本、目镜的固定光阑和眼睛的视网膜或相机探测器的表面。根据定义，在一个平面上聚焦的物体也会在该光路的其他共轭平面上聚焦。在每个光路（成像和照明）中，有四个独立的平面，它们共同构成共轭平面组。

回顾一下，柯勒照明（图 3(a)）中照明光线路径中的共轭平面包括：

o 灯丝。

o 聚光镜孔径光阑（位于聚光镜的前焦平面）。

o 物镜的后焦平面。

o 目镜的视点（也称为 Ramsden 盘），位于目镜顶部透镜上方约半英寸（一厘米）处，观察者在观察时将眼睛前部放在该点。

同样，柯勒照明（图 3(b)）中成像光路中的共轭平面包括：

o 视场光阑。

o 聚焦的标本。

o 中间像平面（即目镜固定光阑的平面）。

o 眼睛的视网膜、胶片平面或相机的图像传感器表面。

共轭焦平面通常可用于排除显微镜光学元件中的灰尘、纤维和瑕疵。如果这些伪影清晰对焦，则它们必须位于成像共轭平面组的一部分表面上或附近。该组的成员包括显微镜光端口处的玻璃元件、标本、目镜中的标线和目镜的底部透镜元件。或者，如果这些污染物模糊且失焦，请在共享共轭平面的照明元件组附近寻找它们。此类别中的嫌疑人是聚光器顶部透镜（灰尘和污垢经常积聚在这里）、暴露的目镜透镜元件（来自睫毛的污染物）和物镜前透镜（通常是指纹污迹）。

毫不夸张地说，几乎整个显微镜艺术和科学（如果不考虑标本制备）都取决于视场和孔径光阑的正确使用。值得庆幸的是，这有简单的规则。本节的后续讨论详细描述了如何正确设置显微镜以进行柯勒照明。所有现代实验室显微镜制造商都推荐使用这种技术，因为它可以产生均匀明亮且无眩光的标本照明，从而使用户能够充分发挥显微镜的潜力。如果您熟悉了共轭平面之间的关系，这将变得容易得多。光圈平面（也称为光瞳）负责分辨能力和对比技术，可以通过滤光片和光阑设置进行控制。相反，视场平面包含由显微镜的光学元件形成的图像，是用于测量长度的标线和刻度的所在地。视场平面通过视场光阑进行控制。

显微镜底座中的视场光阑仅控制到达聚光镜的光束的宽度。此可变光圈不会影响光学分辨率、数值孔径或照明强度。正确调整视场光阑（实际上，位于光路中心并打开到刚好位于视场之外）对于防止眩光（会降低观察到的图像的对比度）非常重要。当尝试对对比度较低的样本进行成像时，消除多余的光线尤为重要。当视场光阑打开得太远时，来自样本的散射光和从光学表面以斜角反射的光会降低图像质量。

台下聚光镜通常直接安装在显微镜台下的支架中，可以通过旋转滚花旋钮独立于台面升高或降低支架。孔径光阑可以通过摆臂、杠杆或旋转聚光镜外壳上的套环来打开和关闭。应该注意的是，正确调整台下聚光镜可能是实现正确柯勒照明的最关键方面。然而不幸的是，聚光镜未对准和聚光镜孔径光阑调整不当是造成图像质量下降和显微摄影质量差的主要原因。

反射光显微镜

反射光显微镜通常被称为入射光、落射照明或冶金显微镜，是荧光和成像标本的首选方法，即使研磨至 30 微米厚，这些标本仍保持不透明。属于这一类别的标本范围非常广泛，包括大多数金属、矿石、陶瓷、许多聚合物、半导体（未加工的硅、晶片和集成电路）、矿渣、煤、塑料、油漆、纸张、木材、皮革、玻璃内含物和各种专用材料。由于光无法穿过这些标本，因此必须将其引导到表面上，并最终通过镜面反射或漫反射返回显微镜物镜。如上所述，这种照明通常被称为落射照明、落射照明或垂直照明（基本上来自上方），与穿过标本的透射（透射）照明形成对比。

如今，许多显微镜制造商都提供先进的型号，允许用户交替或同时使用垂直和透射照明进行研究。图 4 显示了为两种照明类型配置的典型显微镜（此图中未显示透射光源和光路）。反射光的光路始于来自反射光灯罩（图 4 中的上部灯罩）的照明光线。这束光接下来穿过集光透镜并进入垂直照明器，在那里它由光圈和视场光阑控制。穿过垂直照明器后，光被分光镜（半反射镜或椭圆形第一表面镜）反射通过物镜以照亮标本。从标本表面反射的光重新进入物镜并进入双目头，在那里它被引导到目镜或用于显微摄影的端口。反射光显微镜通常是工业应用领域，特别是在快速发展的半导体领域，因此代表了显微镜研究中最重要的一个部分。

典型的直立式复合反射光显微镜有两个目镜观察筒（图 4），通常还有一个三目筒头，用于安装传统或数字/视频摄像系统（未显示）。标准设备目镜的放大倍数通常为 10 倍，大多数显微镜都配备了一个可容纳四到六个物镜的鼻托。载物台由一个可在 x 和 y 方向上平移的标本支架进行机械控制，整个载物台单元能够通过粗调和微调机制进行精确的上下移动。内置光源范围从 20 瓦和 100 瓦的钨卤灯泡到荧光显微镜中使用的更高能量的汞蒸气灯或氙气灯。光线从灯箱穿过一个垂直照明器，该照明器位于鼻托上方，但在观察筒头的下侧下方。标本的顶面直立（通常没有盖玻片）在载物台上，面向物镜，物镜已旋转到显微镜的光轴中。垂直照明器水平放置，与显微镜光轴成 90 度角，与台面平行，灯罩安装在照明器背面。粗调和微调旋钮可以大幅度或小幅度地升高或降低载物台，使标本清晰对焦。

倒置显微镜支架将垂直照明器集成在显微镜主体内。倒置反射光显微镜可以使用多种类型的物镜，并且可以实现所有反射光照明模式：明场、暗场、偏振光、微分干涉对比和荧光。一些仪器包括用于放大图像的放大倍率转换器、对比度滤光片和各种标线。由于倒置显微镜是金相学家最喜欢的仪器，因此它通常被称为金相显微镜。制造商正在大量转向在反射光显微镜中使用无限远校正光学元件，但仍有数千台固定镜筒长度的显微镜在使用，其物镜的校正镜筒长度在 160 至 210 毫米之间。

在垂直照明器中，光线从光源（通常是 12 伏 50 或 100 瓦钨卤素灯）发出，穿过聚光透镜、可变孔径孔径光阑开口和可变且可居中的预聚焦视场孔径光阑的开口。然后，光线照射到部分镀银的平面玻璃反射器上，或者照射到带有椭圆形开口的镜子的全镀银边缘上，以进行暗场照明。在明场反射照明中，平面玻璃反射器在面向光源的玻璃侧部分镀银，在面向观察管的玻璃侧涂有防反射涂层。因此，光线向下偏转到物镜中。镜子与沿垂直照明器传播的光路成 45 度角倾斜。

在反射光显微镜中，样本对入射光线的吸收和衍射通常会导致图像中出现明显变化，从黑色到各种灰色，如果样本有颜色，则为彩色。此类样本称为振幅样本，可能不需要特殊的对比方法或处理即可使其细节可见。其他样本的强度和/或颜色差异很小，以至于在明场反射光显微镜中极难辨别和区分其特征细节。后者样本的行为与透射光工作中常见的相位样本非常相似，适用于暗场和反射光微分干涉对比应用。

结论

有效的样品照明非常依赖于显微镜中所有光学元件（包括照明源）的正确对准。认真的显微镜技术人员应熟悉每个元件的调整范围，并应练习根据不同的样品和物镜对准它们。不均匀的照明会对显微照片和数字图像的质量产生严重影响，从而导致各种其他不良影响。一些最新的显微镜配备了不允许调整的预居中灯，有些甚至提供没有横向调整机制的聚光镜。在进行显微摄影之前，务必确保这些显微镜在工厂已对准以获得适当的柯勒照明。仔细阅读显微镜使用说明书和/或询问您的工厂技术代表，了解有关如何优化这些显微镜照明的重要细节。