柯勒照明

样本照明是获得显微镜和关键显微摄影或数字成像中高质量图像的最重要变量。1893 年，卡尔蔡司公司的 August Köhler 首次引入了柯勒照明，作为一种提供最佳样本照明的方法。制造商设计了现代显微镜，以便集光透镜和显微镜底座内置的任何其他光学元件将灯丝的放大和聚焦图像投射到正确放置的载物台下聚光镜的孔径光阑平面上。关闭或打开聚光镜光阑可控制从聚光镜发出并从各个方位到达样本的光线的角度。由于光源未聚焦在样本水平，因此样本水平的光线基本上没有颗粒感且延伸，并且不会因聚光镜玻璃表面上的灰尘和瑕疵而受到损害。打开和关闭聚光镜孔径光阑可控制到达样本的光锥的角度。聚光镜孔径光阑的设置以及物镜的孔径决定了显微镜系统的实际数值孔径。随着聚光镜光阑的打开，显微镜的工作数值孔径会增加，从而提高分辨力和透光率。穿过并照亮标本的平行光线会聚焦在物镜的后焦平面上，在此可以清晰地看到可变聚光镜孔径光阑的图像和光源的图像。

显微镜在照明方面的正确配置可能是光学显微镜中最容易被误解的概念之一，也是实现最佳性能必须满足的关键参数。照明源发出的光的强度和波长光谱非常重要，但更重要的是，从灯丝上各个位置发出的光必须收集并聚焦在聚光镜孔径光阑的平面上。图 1 显示了在显微镜中建立适当照明所必需的共轭场和孔径平面。本节介绍了建立柯勒照明（用于透射和反射光显微镜）的指导原则。正确执行此过程后，应该能够成功进行观察和成像。

准备显微镜进行柯勒照明的第一步涉及在明场条件下观察标本所需的基本程序。首先，如果聚光镜包含相位环、微分干涉对比棱镜或其他遮光罩和滤光片，请将转盘旋转到明场光圈，该光圈应处于打开状态，并且不应安装滤光片或棱镜。其次，选择合适的标本。最好的标本是染色良好的明场样本，例如非常薄（8 微米或更薄）的动物或植物组织。如果没有准备好的载玻片，可以将一小块 35 毫米胶片（例如透明胶片或负片）粘贴或胶合到干净的玻璃显微镜载玻片上，大小约为 10 x 10 毫米，并用盖玻片压平。

建立柯勒照明的步骤

o 打开光源，将一小张纸放在显微镜底座的照明视场光阑聚光镜正上方（图 2(a)）。此练习的目的是检查光源是否正常工作，是否能将光线投射到显微镜中。如果观察不到光线，且纸张仍然很暗，请检查电源线、照明器，或许还有电源装置中的保险丝，以确保电气元件完好无损。如果不完好，请更换照明灯。当显微镜正常运行时，纸上会显示一个小光点（图 2(a)）。

o 接下来，转动控制杆或旋钮，将视场光阑打开到最大位置（完全打开）。投射到纸张上的光斑（图 2(b)）将达到其最大直径。

o 下一步是移动纸张并将其放置在样本和物镜之间（图 3（a）），然后完全打开聚光镜孔径光阑（通常由位于聚光镜外壳上的杠杆或滚花旋钮控制）。随着聚光镜光阑缓慢打开，投射到纸张上的光强度将增加，在完全打开的设置下达到最大亮度。当使用配备有摆动式前透镜元件的低数值孔径聚光镜时，请在尝试此过程之前从光路中移除摆动透镜。

o 可以使用驱动旋钮调整聚光镜高度，该旋钮可沿显微镜光轴向上和向下移动该组件（图 3(b)）。设置聚光镜高度，使前透镜位于样品载玻片下表面下方约 1 至 3 毫米处。确保聚光镜前透镜不接触载玻片（或将其向上推离载物台）。在极端情况下，将聚光镜推入样品会导致样品从固定导轨上滑出载物台。现代显微镜通常配备可调节止动螺钉，可将聚光镜的顶部位置固定在预定高度。

o 现在应该可以在显微镜目镜中辨别光线（图 4(a)）。如果光线太亮（通常亮到让人感到不舒服），请降低强度，直到找到舒适的水平。接下来，通过双目镜筒的折叠桥设置瞳距。这可以通过挤压镜筒来减少距离或拉开镜筒来增加它们之间的距离来实现。当可以通过目镜轻松看到一个大光圈（而不是两个）时，就达到了正确的距离。下一步是检查显微镜是否配备了调焦目镜。如果是，请将可移动目镜调至零位。戴眼镜的人可以戴着眼镜。

o 凝视显微镜，小心地上下移动载物台（包括标本），直到尽可能清晰地看到图像细节（图 4(b)）。此时，可能会有亮点和暗点或部分光圈遮挡视野，因为照明配置仍未完成。

o 现在，显微镜的基本组件已设置完毕，仪器已准备好配置为柯勒照明。第一步是缩小视场光阑的尺寸，并通过调节旋钮上下移动聚光镜，直到看到视场光阑叶片边缘的清晰图像（图 5(a)）。如果此策略不起作用，请更改视场光阑的尺寸并重试。在许多情况下，聚光镜尚未居中，因此视野中只有一个边缘将包含视场光阑叶片的元素。

o 在此阶段，视场光阑清晰对焦，但聚光镜尚未居中。显微镜聚光镜安装架上的定心旋钮用于使聚光镜居中（图 5(b)）。将视场光阑关闭至其最小开口，并使用定心螺钉将明亮开口重新定位到视场中心（十字线标线对于确定视场中心非常有用）。一旦聚光镜居中，打开视场光阑，直到其叶片完全移出视场。

o 此时，视野中应该已经出现了合适的图像。剩下的唯一任务就是优化对比度。请记住，您首先打开了聚光镜的光圈，以便看到更多光线（如上所述）。现在必须校正光圈大小，以提高对比度并在对比度和分辨率之间找到合适的平衡。请记住，将聚光镜光圈关闭得太紧会严重降低分辨率并使图像明显变暗。

o 如果从双目镜筒支架上取下目镜并直接观察镜筒内部，则可以直接看到叠加在物镜后焦平面（物镜光瞳）上的孔径光阑（图 6（a））。为获得最佳观察效果，您的眼睛应距离镜筒 10 到 20 厘米。看着镜筒时，打开和关闭聚光器孔径光阑，直到您可以清楚地识别物镜光瞳中的图像。最后，设置光阑直径，使其照亮光瞳直径的 65% 到 80%（见图 6（b）），提供几乎全分辨率和最佳对比度。在选择分辨率时通常会做出这样的折衷，因为主要是对比度使图像可以被眼睛接受。调整聚光器孔径光阑后，将目镜重新插入双目观察镜筒支架中。

现在，显微镜应已正确配置，可在柯勒照明下观察标本，但仅适用于用于设置仪器的物镜。当另一个物镜旋转到光学系统中时，应始终调整聚光镜光圈和视场光阑以获得最佳照明（实际上是对比度与分辨率）条件。但是，通常不需要在每次使用新物镜时卸下目镜。一旦为 10 倍物镜设置了孔径光阑尺寸，通常只需通过可视化图像来调整其他物镜的尺寸即可。首先打开光圈直至达到光圈，然后慢慢关闭光圈，直到图像开始变得稍微变暗并且对比度同时增加。通常，最重要的参数是实现合适的对比度。

从以上讨论中可以明显看出，聚光镜孔径光阑应设置在能够提供直射光和偏光的折衷混合的位置，这在很大程度上取决于样本的吸收、衍射和折射特性。这必须在不使图像充斥着模糊细节和呈现错误对比度增强的伪影的情况下实现。产生最佳显微照片所需的图像细节和对比度量还取决于折射率、光学特性和其他与样本相关的参数。

当孔径光阑错误地关闭得太远时，偏离的光会开始遮挡直接照明光线，从而产生衍射伪影，导致显微照片中出现可见的条纹、条带和/或图案形成。其他问题（例如折射现象）也会在图像中产生不真实的明显结构。或者，将聚光镜光阑打开得太大会导致样品和显微镜内的光学表面产生不必要的眩光和光散射。这会导致对比度严重下降，图像细节消失。正确的设置因样品而异，经验丰富的显微镜学家很快就会学会通过观察图像来准确调整聚光镜孔径光阑（和系统的数值孔径），而无需在物镜的后焦平面上查看光阑。事实上，许多显微镜学家认为，大幅减少显微镜系统的数值孔径以优化图像质量是显微摄影中最重要的一步。

当调整显微镜的照明系统以实现适当的柯勒照明时，它必须满足几个要求。样本平面的照明面积必须至少与任何给定物镜的视野一样大。此外，光线必须具有均匀的强度，数值孔径必须从最大值（等于物镜的数值）变化到最小值，这取决于样本的光学特性。