反射光显微镜

对于想要检查金属样品结构、陶瓷表面、集成电路或印刷纸质文件的人来说，透射光显微镜通常用处不大。因此，反射光显微镜应运而生。反射光显微镜通常被称为入射光、落射照明或金相显微镜，是荧光和对即使研磨至 30 微米厚度仍不透明的样本进行成像的首选方法。与荧光显微镜非常相似，在反射明场显微镜中，样本从上方通过物镜照射。柯勒照明原理适用于物镜及其光瞳平面也用作聚光镜的情况。

属于这一类别的样本范围非常广泛，包括大多数金属、矿石、陶瓷、多种聚合物、半导体（未加工的硅、晶片和集成电路）、矿渣、煤、塑料、油漆、纸张、木材、皮革、玻璃夹杂物和各种各样的专用材料。由于光无法穿过这些样本，所以必须将其引导到表面上，并最终通过镜面反射或漫反射返回显微镜物镜。如上所述，这种照明通常被称为落射照明、落射照明或垂直照明（基本上来自上方），与穿过样本的透射（透射）照明相对。图 1 显示了几种反射光样本。图 1(a) 显示了使用反射光微分干涉对比 ( DIC ) 的集成电路表面，而图 1(b) 显示了在明场中捕获的手表机制的宝石轴承。暗场是另一种有用的反射光技术，如图 1(c) 中显示超导线缆表面结构的图像所示。最后，可以使用偏振反射光显微镜对磁性薄膜（图 1(d)）进行成像，以检查影响薄膜均匀性的表面缺陷（气泡）。

反射光显微镜

如今，许多显微镜制造商都提供先进的型号，允许用户交替或同时使用垂直和透射照明进行研究。图 2 显示了为两种照明类型配置的典型显微镜（此图中未显示透射光源和光路）。反射光的光路始于来自反射光灯罩（图 2 中的上部外壳）的照明光线。这束光接下来穿过集光透镜并进入垂直照明器，在那里由光圈和视场光阑控制。穿过垂直照明器后，光被分光镜（半反射镜或椭圆形第一表面镜）反射通过物镜以照亮标本。从标本表面反射的光重新进入物镜并进入双目头，在那里它被引导到目镜或用于显微摄影的端口。反射光显微镜通常是工业应用领域，尤其是在快速发展的半导体领域，因此代表了显微镜研究中最重要的部分。

典型的直立式复合反射光显微镜具有一个带有两个目镜的观察筒（图 2），并且通常具有一个三目筒头，用于安装传统或数字/视频摄像系统（未显示）。标准设备目镜的放大倍数通常为 10 倍，大多数显微镜都配备了一个可容纳四到六个物镜的转盘。载物台由一个可在 x 和 y 方向上平移的标本支架进行机械控制，整个载物台单元能够通过粗调和微调机制进行精确的上下移动。内置光源范围从 20 和 100 瓦的钨卤灯泡到荧光显微镜中使用的更高能量的汞蒸气灯或氙气灯。光线从灯箱穿过一个垂直照明器，该照明器位于转盘上方，但在观察筒头的下侧下方。标本的顶面直立（通常没有盖玻片）在载物台上，面向物镜，物镜已旋转到显微镜的光轴中。垂直照明器水平放置，与显微镜光轴成 90 度角，与台面平行，灯罩安装在照明器背面。粗调和微调旋钮可以大幅度或小幅度地升高或降低载物台，使标本清晰对焦。

倒置反射光显微镜支架将垂直照明器整合到显微镜主体内。倒置反射光显微镜可使用多种物镜，并且可以使用所有反射光照明模式：明场、暗场、偏振光、微分干涉对比和荧光。一些仪器包括用于放大图像的放大倍率变换器、对比度滤光片和各种标线。由于倒置显微镜是金相学家最喜欢的仪器，因此它通常被称为金相显微镜。制造商大多在反射光显微镜中转向使用无限远校正光学系统，但仍有数千台固定管长显微镜在使用，其物镜的校正管长在 160 至 210 毫米之间。

在倒置支架上（基本结构类似于生物学中常用的倒置组织培养式显微镜框架），标本被放置在载物台上，其感兴趣的表面朝下。这种设计的主要优点是，当样本太大而无法放入直立显微镜的范围内时（例如大型岩石样本和工业材料），可以轻松检查样本。此外，只有标本面向物镜的一侧需要完全平坦。物镜安装在载物台下方的鼻托上，其前透镜朝上朝向标本，通过上下移动鼻托或整个载物台来实现聚焦。

在垂直照明器中，光线从光源（通常是 12 伏 50 或 100 瓦钨卤素灯）发出，穿过聚光透镜、可变孔径光圈开口和可变且可定心的预聚焦视场光圈开口。然后，光线照射到部分镀银的平面玻璃反射器上，或照射到带有椭圆形开口的镜子的全镀银边缘上，以进行暗场照明。平面玻璃反射器在面向光源的玻璃侧部分镀银，在明场反射照明中，在面向观察管的玻璃侧涂有防反射涂层。因此，光线向下偏转到物镜中。镜子与沿垂直照明器传播的光线路径成 45 度角倾斜。

在反射光显微镜中，样本对入射光线的吸收和衍射通常会导致图像中出现明显变化，从黑色到各种灰色，如果样本是彩色的，则为彩色。此类样本称为振幅样本，可能不需要特殊的对比方法或处理即可使其细节清晰可见。其他样本的强度和/或颜色差异很小，以至于在明场反射光显微镜中极难辨别和区分其特征细节。后者样本的表现与透射光工作中常见的相位样本非常相似，适用于暗场和反射光微分干涉对比应用。

反射光显微镜物镜

反射光的分辨力基于光波长与数值孔径之间的关系（阿贝方程），与透射光相同。当仪器调整为在柯勒照明下工作时，反射光照明可实现光学性能。柯勒照明的功能（除了提供均匀分散的照明外）是确保即使光源是盘绕灯丝灯，物镜也能提供出色的分辨率和良好的对比度。在许多情况下，现代反射光显微镜也可以使用透射光操作，因为所有物镜都保持了共焦距。

反射光物镜可通过装饰性外筒上的Epi或类似铭文识别（见图 3）。它们与透射光物镜有两个不同之处。反射光物镜的镜片表面涂有防反射层，可防止照明光反射至目镜。此类反射会叠加在图像上并产生干扰效果。第二个区别是，这些物镜是针对没有盖玻片的样本设计和光学校正的。材料科学（反射光显微镜使用最为频繁的领域）中的绝大多数样本通常在没有盖玻片的情况下观察。因此，与透射光物镜相比，更高数值孔径的物镜需要不同的光学计算。

反射光显微镜照明器

在反射光显微镜中，照明光到达标本，标本可能会吸收部分光并反射部分光，方式可以是镜面反射或漫反射。向上返回的光可按照物镜的数值孔径被物镜捕获。光进入物镜后，会穿过部分镀银的镜子（或在暗场中穿过椭圆形开口）。对于无限远校正物镜，光以平行（从每个方位角）波前从物镜中射出，将标本的图像投射到无限远。平行光线进入筒镜，在目镜固定光阑开口的平面（中间像平面）上形成标本图像。值得注意的是，在这些反射光系统中，物镜具有双重功能。对于传到标本的光波，物镜充当匹配的、经过良好校正（始终正确对齐）的聚光镜。或者，对于样本反射的波，物镜充当成像光学系统，其通常的作用是将载像光线投射到目镜上。当仪器调整为产生柯勒照明（如下所述）时，反射光照明可实现最佳性能。柯勒照明的功能（除了提供均匀分散的照明外）是确保即使光源是盘绕灯丝灯，物镜也能提供出色的分辨率和良好的对比度。

几种现代反射光照明器被描述为通用照明器，因为只需几个附加配件，几乎无需拆卸，显微镜就可以轻松地从一种反射光显微镜模式切换到另一种模式。通常，反射器可以从光路中完全移除，以便进行透射光观察。通用照明器可能包括用于明场的部分反射平面玻璃表面（半反射镜）（见图 4（a））和用于暗场观察的全镀银反射表面，该表面具有椭圆形、位于中心的透明开口（图 4（b））。设计最佳的垂直照明器包括用于收集和控制光线的集光透镜、孔径光阑和预聚焦、可居中的视场光阑，以实现理想的柯勒照明。

垂直照明器还应预留空间插入用于对比、数字成像和显微摄影的滤光片，以及用于偏振光和微分干涉对比 ( DIC ) 照明的起偏器、检偏器和补偿板。在设计用于无限远校正物镜的垂直照明器中，照明器可能还包括管透镜。垂直照明器的后端固定有一个灯箱 ( 图 2 )，其中通常包含一个钨卤灯。对于荧光工作，可以用含有汞燃烧器的配件代替灯箱。灯可以由显微镜支架内置的电子设备供电，或者在荧光下通过外部变压器或电源供电。

反射光显微镜中的柯勒照明

在反射光显微镜垂直照明器中，光源的位置使得钨卤素灯丝位于聚光透镜主焦点附近。在柯勒照明中，灯聚光透镜充当显著放大的二次光源，以增强整体照明。柯勒照明的主要要求之一是灯丝的图像最终必须投射到物镜的后焦平面上，在反射光照明的激发过程中，物镜还兼作（通常高数值孔径）聚光镜。光源最好填满整个物镜孔径，以最大限度地提高辐射强度并产生均匀的照明场。在许多情况下，将毛玻璃滤光片放在灯箱和中性密度滤光片之间的垂直照明器中，以增加照明的均匀性。但是，由于扩散滤光片也会降低照明水平，因此应尽可能避免使用它们。

在反射光柯勒照明（图 5 中示意性说明）中，光源的图像通过聚光透镜聚焦到位于垂直照明器中的孔径光阑上。该光阑与物镜后孔径和灯丝共享一个共轭平面，因此决定了照明场孔径大小。光源、垂直照明器孔径光阑和物镜后焦平面（瞳孔）共同构成照明共轭平面组。与透射光显微镜的情况不同，孔径光阑和光源成像到物镜（充当聚光器）后孔径平面上，而不是物理地位于此位置。作为此配置的额外好处，所有障碍物（例如光阑）都从光路中移除。打开或关闭孔径光阑可用于控制杂散光并调节照明强度（数值孔径），而不会改变照明场的大小。在图像中，调整孔径光阑会影响亮度和对比度。

反射光柯勒照明中的共轭平面成像或视场组由视场光阑、标本表面和中间像平面组成。因此，当视场光阑聚焦在标本平面上时，光源图像会明显偏离焦点，以提供均匀的照明场。视场光阑控制照明场的大小，而不会影响被观察区域的照明强度。实际上，视场光阑开口尺寸应尽可能小，以增加图像对比度。尽管大多数基于灯丝的光源产生的照明强度不均匀，但柯勒照明仍能均匀地照亮标本场。当显微镜配置正确时，物镜的后焦平面将被完全照亮，从而提供一个从边缘到边缘均匀明亮的视场。在理想情况下，柯勒照明用一组会聚的波前照射标本，每个波前都来自光源上成像到聚光镜光圈中的不同点。在正确配置的反射光显微镜中，结果是最佳的图像对比度和分辨率。

反射光显微镜对比模式概述

由于物镜在反射光显微镜中起双重作用（也可用作聚光镜）（参见图 6（a）），因此有足够的空间将辅助组件引入由从物镜后孔传播到筒透镜的平行光波前束占据的无限远空间（称为光学系统的****观察侧；参见图 6（a））。此外，可以在光进入物镜之前将偏光或滤光片组件插入垂直照明器中（称为光学系统照明侧）。许多现代显微镜还为影响两条光路的组件提供了额外的空间。这个空间通常构建为物镜转换器中的插槽，其中可以轻松插入包含滤光片或偏振器的滑块。

在反射光显微镜中，通常采用多种技术来引入对比度，包括暗场照明、偏振光和微分干涉对比。反射暗场显微镜是探索材料表面浮雕的理想方法，使用包含椭圆形开口的专用镜组将垂直照明器的波前导向物镜（见图 4 和图 6(b)）。该光线穿过显微镜物镜的外套管，撞击环形凹面镜，凹面镜将波前以高入射角导向标本表面。如果标本充当完美镜子（实际上，表面上没有浮雕特征），则不会有光线从标本反射回物镜，图像保持黑暗。然而，存在浮雕轮廓的区域会将光线引导回物镜前透镜，并在非常暗的背景下观察到明亮的特征。请注意，在暗视场反射光显微镜中，垂直照明器中的视场和孔径光阑应打开到最宽点，以便照亮镜子组件的光束不会被部分阻挡。

偏振反射光显微镜（图 6(c)）是一种适用于检查包含在反射过程中改变偏振状态的结构的表面的技术。例如，使用此方法可以轻松检查矿石样品中的结构晶粒以及许多金属合金和薄膜。在图 6(c) 中概述的光学配置中，照明波前遇到偏振器，该偏振器放置在垂直照明器中，位于将光引导到物镜中的镜子单元之前。线性偏振光波聚焦到样本表面上并反射回物镜。在离开物镜孔径作为平行波前束后，光随后投射到相对于偏振器成 90 度方向的第二个偏振器（分析器）上。只有去偏振的波前才能穿过分析器到达管透镜。辅助 lambda 板也可以插入光学系统中分析器之前，以检查双折射的迹象（将灰色变为彩色对比度）。这种方法有时被称为敏感色调。在反射偏振光中使用放大倍数非常低的物镜的情况下，在物镜前透镜元件上放置一个由四分之一波长的 lambda 板组成的可旋转光学板（称为Antiflex 盖），以阻挡物镜本身的反射。当样本的反射率非常低时，例如在煤样中观察到的，Antiflex 方法也特别有用。

将对比度引入反射光成像的最有效技术之一是微分干涉对比，它允许可视化表面的微小高度差异。在光学配置（图 6(d)）中，双折射棱镜（也称为沃拉斯顿棱镜或诺马斯基棱镜，具体取决于设计）放置在物镜正上方的无限空间中，并在垂直照明器中安装偏振器（类似于偏振光）。棱镜将偏振光波前分成两个正交偏振光束，然后到达样本。这些垂直光束撞击样本，在存在表面浮雕的区域产生横向位移。如果表面完全平坦，则不会观察到任何特征。但是，如果两个波前之间存在一个小台阶（参见图 6(d)），则其中一束光束必须行进更长的路径，并被分配此路径差。平行光束穿过物镜和棱镜后返回显微镜，然后穿过第二个偏振器（分析器），干涉产生中间图像，路径差被转换成眼睛可以看到的灰度值。与偏振光显微镜类似，可以在分析器下方放置一个 lambda 板，将灰度值转换为彩色色调。